Окраска грамположительных бактерий

Содержание
  1. Грама метод
  2. Техника окраски по Граму
  3. Механизм окраски по Граму
  4. Окраска по Граму
  5. Этимология
  6. Использование
  7. Техника проведения окрашивания
  8. Подготовка материала для окраски
  9. Фиксация
  10. Процесс окрашивания
  11. Цвет бактерий, грамположительные и грамотрицательные бактерии
  12. Окрашивание бактерий
  13. Простое окрашивание
  14. Комбинированные (сложные) методы окрашивания
  15. Окраска по Граму
  16. Окраска по Цилю-Нельсену
  17. Метод Пешкова
  18. Окраска по Леффлеру
  19. Естественная окраска колоний микроорганизмов
  20. Липохромы
  21. Продигиозин
  22. Бактериофлуоресцин
  23. Окраска по Граму | Андромед
  24. Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет
  25. Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет
  26. Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение
  27. Структура клеточной стенки
  28. Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий
  29. Суть метода окрашивания
  30. Причины различного характера окрашивания
  31. Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

Грама метод

Окраска грамположительных бактерий

Грама метод (Н. Ch. J. Gram, датский врач, 1853—1938) — дифференциальная окраска бактерий; применяется для окраски бактерий в мазках из культур, экссудатов, тканей и пр. Метод предложен в 1884 г. и получил широкое распространение в бактериологии.

Сущность метода состоит в том, что при слабощелочной реакции бактерии окрашиваются основными красителями трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет).

Обработка йодом или пикриновой к-той приводит к прочной фиксации красителя в определенных видах бактерий; последующее промывание окрашенного препарата нейтральным спиртом или ацетоном не обесцвечивает их (грамположительные бактерии). У других бактерий под влиянием йода не образуется прочного комплекса, и обработка спиртом или ацетоном приводит к обесцвечиванию.

Эти бактерии (грамотрицательные) выявляются путем докрашивания контрастной краской. Грамположительность и грамотрицательность — важный диагностический признак в дифференциальной диагностике некоторых инфекционных заболеваний.

При окраске тканей по Грама методу клеточные структуры (за исключением хроматина делящихся ядер зернышек, базофильных клеток и рогового слоя эпидермиса) обесцвечиваются спиртом. Окраска по Граму вариабельна и зависит от многих факторов. Поэтому для получения точных и сравнимых результатов всегда следует придерживаться стандартной методики.

Для фиксации препарата чаще используют высокую температуру, хотя могут быть применены и другие способы (см. Фиксация). Следует учитывать, что способ фиксирования влияет на ход окраски. Лучшими основными красителями для этого метода являются метилвиолет, генцианвиолет (см.) и др.

Удовлетворительные результаты дают также основной фуксин, виктория синяя и др. В качестве протравы обычно применяют йод или пикриновую к-ту, но могут быть использованы бром, двухромовокислый калий, тринитрокрезол и др. Из обесцвечивающих агентов чаще применяют этиловый спирт и ацетон.

Ацетон более активен в качестве средства, обесцвечивающего грамотрицательные бактерии. Используется также смесь из этих веществ.

Некоторые бактерии (Corynebacterium diphtheriae, Shigella dysenteriae, Bac. proteus) характеризуются грамнеустойчивостью, т. е. они находятся между безусловно грамположительными и безусловно грамотрицательными видами; отдельные клетки одного и того же вида также подвержены аналогичным колебаниям. Напр.

, в цепочке альфа-гемолитического стрептококка среди грамположительных кокков часто можно наблюдать грамотрицательную клетку. Особое влияние на окраску оказывает возраст культуры. Грампозитивность уменьшается с возрастом бактерии. Поэтому в старых культурах грамположительных видов обнаруживают большое количество грамотрицательных клеток.

Мертвые и частично подвергшиеся аутолизу бактериальные клетки грамотрицательны. Результат окраски зависит от среды, в к-рой выращивается микроб. При оценке полученных данных, особенно в тех случаях, когда в грамотрицательных культурах обнаруживают грамположительные клетки, необходимо учитывать толщину мазка, влияющую на результат окраски.

Желательно, чтобы толщина мазка была не больше толщины одной клетки, т. к. в толстом мазке, содержащем грамотрицательные микробы, часто наблюдаются грамположительные особи.

Техника окраски по Граму

Для окраски необходимо следующее: карболовый р-р красителя трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет или метилвиолет); раствор Люголя (2 г йодистого калия, 1 г йода кристаллического, 300 мл дистиллированной воды) щелочной или нейтральной реакции; спирт 96% нейтральной реакции; р-р контрастной краски (фуксин Пфейффера, 1% водный р-р нейтральрота и др.).

Мазок, фиксированный жаром, окрашивают генцианвиолетом или другим красителем 1—2 мин., промывают водой и наливают на препарат р-р Люголя (на 1 мин.), после чего дифференцируют спиртом 7 г — 1 мин. до появления серо-фиолетовых струек краски.

Затем препарат промывают водой и докрашивают одной из контрастных красок. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, клетки и ткани — в красный. Предложены различные модификации метода Грама — А. И.

Синева (применение генцианвиолетовой бумажки вместо карболового р-ра краски), Г. П. Калины, Хаккера (G. J. Hucker), Берк (V. Burke) и др.

Механизм окраски по Граму

Существует несколько теорий механизма окраски по Граму. Предполагалось, что грамположительная окраска обусловлена ненасыщенными жирными к-тами, имеющимися у некоторых бактерий и способными соединяться с йодом, в результате чего «эктоплазма» бактерий становится непроницаемой для спирта и извлечения адсорбированного красителя не происходит.

Другая теория [Стерн, Стерн (E. Stearn, A. Stearn), 1928] связывает механизм окраски по Граму с различиями в кислотно-основных свойствах протоплазмы у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Эти две группы бактерий характеризуются различной изоэлектрической точкой (см.), к-рая у грамположительных видов находится при pH 2,0—3,0, а у грамотрицательных ок. 5.

Наряду с этим следует указать, что протравы, применяемые при окраске (йод, пикриновая к-та, бихромат и др.), являются окислителями и имеют тенденцию превращать некоторые комплексы протоплазмы в более кислые соединения, сдвигая изоэлектрическую точку бактерий в кислую сторону.

Свойство йода и других протрав сдвигать изоэлектрическую точку в кислую сторону у грамположительных бактерий выражено в большей степени, чем у грамотрицательных, что указывает на определенные хим. различия между этими микробами.

Поскольку сродство к красителям и резистентность к обесцвечиванию тем сильнее, чем ниже Изоэлектрическая точка бактерий, а исходное значение pH у грамположительных бактерий ниже, чем у грамотрицательных, и после обработки йодом оно в значительной степени еще снижается, создаются условия для прочной фиксации краски.

Химическая теория [Хенри, Стейси (Н. Henry, М. Stacey), 1943] объясняет грамположительность наличием на поверхности цитоплазмы клетки комплекса из белка и рибонуклеата магния. Этот комплекс можно экстрагировать из тела грамположительных бактерий желчными солями и превратить их в грамотрицательные.

Полученный таким способом грамотрицательный вариант можно вновь превратить в грамположительные добавив к нему выделенный экстракт. Превращение грамположительных бактерий в грамотрицательные происходит также при обработке убитых бактерий рибонуклеазой.

Присутствие протеин-рибонуклеата магния на поверхности клетки доказывается тем, что успех окраски зависит от структурной целостности бактерий. При механических повреждениях, разрыве оболочки, раздавливании, растирании можно наблюдать превращение поврежденных бактерий в грамотрицательные.

Грамположительность сохраняется у морфологически целостных клеток.

Имеются данные, свидетельствующие, что в конечном итоге окраска по Граму зависит от разной проницаемости клеточных стенок у грамположительных и грамотрицательных бактерий.

В частности, указывается, что клеточная стенка грамположительных бактерий содержит больше пептидогликана, чем грамотрицательных бактерий, и, что особенно важно, пептидогликаны обеих групп бактерий структурно отличаются друг от друга.

В пептидогликане грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus) остатки N-ацетил мурамовой к-ты содержат О-ацетилгруппы в положении C6, что придает молекулам пептидогликана устойчивость, в частности к лизоциму.

Высказывается предположение, что обработка спиртом при окраске по Граму уменьшает диаметр пор в пецтидогликановом слое у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

В силу этого комплекс генцианвиолет — йод при обработке спиртом удерживаемся грамположительной клеткой и извлекается из грамотрицательной.

Библиография: Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Роуз Э. Химическая микробиология, пер. с англ., М., 1971; .Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О.

Биргера, с. 23, М., 1973; The bacteria, ed. by I. С. Gunsalus a. R. J. Stanier, y. 1, N. Y. — L., 1960; Gram H. C.J. Uber die isolierte Farbung der Schizomyceten in Schnittund Trockenpraparaten, Fortschr. Med., Bd 2, S.

185, 1884.

Д. М. Гольдфарб.

Источник: https://xn--90aw5c.xn--c1avg/index.php/%D0%93%D0%A0%D0%90%D0%9C%D0%90_%D0%9C%D0%95%D0%A2%D0%9E%D0%94

Окраска по Граму

Окраска грамположительных бактерий

Окраска по Граму (или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.

Этимология

Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.

Использование

Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.

В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.

При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом.

При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти.

При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

  1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Источник: https://info-farm.ru/alphabet_index/o/okraska-po-gramu.html

Цвет бактерий, грамположительные и грамотрицательные бактерии

Окраска грамположительных бактерий

Микроорганизмы в своем нативном состоянии не видны не только в оптические, но и в электронные микроскопы. Причиной подобного явления является их прозрачность – ткани микроорганизма имеют коэффициент преломления света подобный стеклу.

Для изучения прокариотов под микроскопом используются различные методы окрашивания, что дает возможность придать цвет бактериям или их частям. Кроме того, микробы обладают тинкториальными свойствами – важной особенностью, состоящей в неодинаковом взаимодействии различных тканей прокариота с красителем.

Окрашивание бактерий

Способов придать цвет микроорганизмам много.

В зависимости от предмета окрашивания используемые для этого методики подразделяют на:

  • позитивные способы, окрашивающие ткани микроорганизмов;
  • негативные методы – окрашивающие пространство вокруг бактерии, в результате чего она становится видна как силуэт на окрашенном фоне.

Как позитивное окрашивание, так и негативное делятся в зависимости от состояния микроорганизма на:

  • витальное (прижизненное) окрашивание – чаще всего применяются слабые растворы метиленового синего, конго красного и толуоидинового синего;
  • поствитальное (фиксированное) окрашивание.

Окрашивание фиксированных образцов наиболее эффективный способ придания бактерии цвета. В зависимости от необходимого результата применяют простые или сложные методы окрашивания.

Простое окрашивание

Так, простые методы поствитального окрашивания бактерии позволяют получить информацию о том, какого размера и формы микроорганизм, установить локализацию и взаимное расположение отдельных прокариотов.

https://www.youtube.com/watch?v=KKK-ueKi_M0

Для придания цвета бактериям обычно используют растворы щелочного метиленового синего или фуксина Пфейфера. Методологически способ несложен: раствор красителя наносится на фиксированный препарат и выдерживается, согласно методике, от 1 до 5 минут, после чего окрашенный образец промывают  (водой) и сушат. Препарат готов, и можно проводить микроскопические исследования.

Комбинированные (сложные) методы окрашивания

При более глубоких исследованиях применяются сложные способы окрашивания фиксированных образцов. Сложные методы придания цвета микроорганизмам подразумевают воздействие на  исследуемый препарат несколькими окрашивающими реагентами, один из которых называют основным, а остальные – дополнительными. Также используются различные обесцвечивающие агенты:

  • кислоты (серная, соляная в различных разбавлениях);
  • спирты (в основном этиловый);
  • ацетон и другие.

Сложные методы окраски позволяют выявить структуру микроорганизма, иные свойства и особенности бактерии.

Наиболее распространенными методами придания цвета фиксированным препаратам являются следующие:

  • метод Грама;
  • методика  Циля-Нельсона;
  • метод Пешкова;
  • окрашивание по Романовскому-Гимзе.

Окраска по Граму

Методика  окрашивания бактерий, предложенная в 1884 году Г. Грамом, получила широкое распространение  и имеет большое значение  для систематики микроорганизмов и  диагностики инфекционных болезней.

Метод Грама основан на биохимических свойствах клеточной стенки прокариотов; он позволяет разделить все микроорганизмы на 2 группы:

  • грамположительные – в результате окрашивания приобретают устойчивый синий цвет;
  • грамотрицательные – обесцвечиваются при промывании, после контрастного окрашивания красителем красного цвета приобретают цвет от красного до розового.

При окрашивании по Граму используют анилиновые красители – метиловый фиолетовый и генциановый – с последующей фиксацией красителя йодом. Окрашенный образец промывают спиртом, после чего получают 2 группы:

  • микроорганизмы, окрашенные в синий цвет, – грамположительные;
  • обесцвеченные бактерии – грамотрицательные.

Обесцвеченные грамотрицательные микроорганизмы обрабатывают красным красителем (сафранин или фуксин), окрашивающим их в цветовом интервале красный – розовый.

Было установлено, что окраска выявляет наличие у грамотрицательных микроорганизмов внешней мембраны, не позволяющей красителю проникнуть в клетку.

К грамположительным бактериям относятся почти все кокки и спорообразующие бациллы, а к грамотрицательным – большая часть неспороносных микробов.

Окраска по Цилю-Нельсену

Данная методика поствитального окрашивания, предложенная немецкими медиками Ф.Цилем и Ф.Нельсоном в1883 г., позволяет определить в пробе кислотоустойчивые бактерии, в частности возбудителей лепры, туберкулеза и микобактериоза.

Методика придания цвета микробам основана на присутствии в клетках кислотоустойчивых прокариотов оксикислот, липидов и воска, что является причиной неудовлетворительного окрашивания разведенными красителями.

При окрашивании по Цилю-Нельсону фиксированный препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля и подогревают над горелкой до появления паров, охлаждают и повторяют процесс 3 раза.

По завершении  препарат промывают водой, обесцвечивают раствором серной или соляной кислот и тщательно промывают.

Далее препарат в течение 1 минуты обрабатывают раствором метиленового синего, промывают водой и высушивают.

В результате цвет кислотоустойчивых микроорганизмов – интенсивно красный, на фоне остальной микрофлоры, имеющей светло-синюю окраску.

При необходимости дифференцировать бактерии лепры от возбудителя туберкулеза применяется метод Семеновича-Марциновского:

  • бактерии лепры окрашиваются в голубой цвет;
  • возбудители туберкулеза – бесцветные.

Метод Пешкова

Окраска по Пешкову проводится для выявления эндоспор грамположительных бактерий. Используют жидкость Карнуа, метиленовый синий, фуксин по Пфейферу (или нейтральный красный).

Результат окрашивания по Пешкову прекрасно микроскопируется:

  • зрелые эндоспоры становятся голубыми;
  • молодые эндоспоры – насыщенно-синие;
  • цитоплазма приобретает красный цвет;
  • хроматин – зерна приобретают фиолетовую окраску.

Окраска микроорганизмов по Романовскому-Гимзе

Метод обеспечивает окрашивание ацидофильных бактерий в разные оттенки красного, а базофильных – в цветовой гамме от пурпура до синего. Методика имеет большое практическое значение при определении паразитов крови (спирохета) – цитоплазма микроорганизмов окрашивается в голубой цвет, а клетки, содержащие ядра, – в красно-фиолетовый.

Окраска по Леффлеру

Метод окраски по Леффлеру позволяет получить зримую картину жгутиков бактерий путем последовательного применения танина и красителя. Также наличие жгутиков может выявить окраска по Морозову:

  • обрабатывают препарат кислотой, при этом жгутики и оболочки разрыхляются;
  • протравливают танином;
  • окрашивают азотнокислым серебром – жгутики и оболочка покрываются толстым слоем препарата и приобретают цвет в гамме от желтого до насыщенно-коричневого.

Кроме того, Леффлер разработал методику окраски дифтерийных бактерий метиленовым синим Леффлера (готовят из спиртового раствора метиленового синего, слабого раствора щелочи и дистиллированной воды). В результате обработки бактериальная палочка приобретает голубой цвет, а гранулы волютина дифтерийных бактерий окрашиваются в темно-синий.

Помимо жгутиков, методики окраски бактерий позволяют определить наличие капсул, для чего применяется методика Бурри-Гинса: последовательная обработка препарата разведенной тушью, спиртом, фуксином Пфейфера. После чего образец промывается водой и высушивается.

Капсулы выглядят как светлые ореолы, расположенные вокруг красных бактерий на темном фоне.

Естественная окраска колоний микроорганизмов

Существует целая группа микроорганизмов, называемая хромогенными бактериями, колонии которых как в природе, так и на искусственных средах окрашены ярко и разнообразно. Цветовая гамма представлена от нежно-лимонного до густого темно-синего и даже черного. Хромогенных бактерий множество – это и кокки, и палочки, и спириллы. Химический состав красителей тоже очень разнообразен.

Независимо от цвета колонии все хромогенные бактерии совершенно бесцветны, окраску обеспечивают капельки, кристаллики или зернышки, расположенные вне клеток и являющиеся отходами жизнедеятельности бактерий. Эти отходы могут растворяться и диффундировать в окружающую среду, что приводит к окрашиванию пространства колонии.

Понятие «хромогенные бактерии» появилось в 1872 году благодаря Ф. Кону. Было выявлено,  что бактерии, обладающие способностью к хромогенезу, не являются естественной, а лишь сборной группой, которую объединяет только способность окрашивать среду.

Неоднократно были предприняты попытки классификации хромогенных бактерий, однако успешных предложено не было.

Сегодня применяется классификация, основанная на растворимости пигмента:

  • пигмент водорастворим;
  • пигмент не растворяется в воде, но растворяется в спирте;
  • нерастворимый ни в воде, ни в спирте пигмент.

Данная классификация несовершенна, что объясняется недостатком информации как по природе пигмента, так и по самой функции хромогенеза.

Хромогенных бактерий известно уже очень много, а сортов красителей, которые они производят, намного меньше. Это объясняется тем, что различные хромогенные бактерии производят один и тот же пигмент.

Все бактериальные пигменты делят на 3 большие группы:

  • липохромы;
  • продигиозин;
  • бактериофлуоресцин.

Липохромы

Колонии, выделяющие липохромы, окрашены в цвета от желтого до красного. К ним относятся почти все кокки и в меньшей степени палочки.

Физико-химические свойства пигмента:

  • агрегатная форма – кристаллики;
  • нерастворим в воде;
  • растворим в органических растворителях (спирт, бензин, эфир, сероуглерод и др.);
  • омыляется горячей щелочью;
  • с концентрированной серной кислотой дает синее окрашивание – липоциановая реакция Цопфа. 

Продигиозин

Бактерии, выделяющие красный пигмент продигиозин, известны с давних времен как бактерии «чудесной крови».

О них упоминал Пифагор, запрещая своим ученикам есть вареные бобы, которые простояли ночь – на них могла появиться «кровь». В Средние века замечали появление «чудесной крови» на продуктах, когда сначала появляются небольшие кровавые капельки, которые очень быстро растут и прямо заливают продукты кровавым слоем.

Появление «чудесной крови» отмечалось на богатых крахмалом продуктах – хлебе, рисе, поленте, вареном картофеле, бывает на мясе или отварных яйцах, но достаточно редко. Может развиться на молоке, тогда слой сливок окрашивается в красный цвет, а само молоко быстро створаживается.

Бактерии «чудесной крови» не являются патогенными, однако некоторые продукты их жизнедеятельности – токсальбумины – обладают токсическими свойствами.

Физико-химические свойства пигмента:

  • жидкость;
  • малорастворим в воде;
  • растворяется в органических растворителях (спирты, эфир, хлороформ, сероуглерод и другие);
  • при взаимодействии со щелочами образуется оранжево-желтая краска;
  • при воздействии кислот образуется карминовая и далее – фиолетовая краска;
  • солнечный цвет разрушает пигмент в растворах.

Бактериофлуоресцин

Флуоресцирующий пигмент вырабатывают маленькие бактерии-палочки, подвижные за счет жгутика на одном конце, все они не образуют спор.

Большая часть бактерий является сапрофитами и имеет широкий ареал обитания. Колонии обнаруживают зелено-травяную флуоресценцию.

Физико-химические свойства пигмента:

  • в чистом виде не выделен, предположительно является белковым веществом;
  • водорастворим;
  • не растворяется в спиртах, эфирах и бензине;
  • концентрированный раствор имеет бледно-желтый цвет и флуоресцирует голубым цветом;
  • обработка щелочью сдвигает флуоресценцию в зеленый цвет;
  • при добавлении кислоты флуоресценция прекращается.

Кроме трех основных пигментов, были выделены пиоцианин (синий), пиоксантин (красно-бурый), синцианеин (синий) и другие.

Одни бактерии образуют пигмент всегда, другие микроорганизмы выделяют пигмент иногда. Есть бактерии, которые всегда выделяют только один пигмент, а есть бактерии, выделяющие несколько различных пигментов.

Хромобактерии изучены недостаточно хорошо, не выявлены причины, от которых зависит потеря хромобактериями способности выделять пигмент. Такие колонии называют лейкорасой. Однако при дальнейших посевах лейкораса может дать нормальное окрашивающее потомство.

Изучение способности бактерий к хромогенезу представляет большое не только научное, но и практическое значение.

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.

Источник: https://probakterii.ru/prokaryotes/raznoe/cvet-bakterij.html

Окраска по Граму | Андромед

Окраска грамположительных бактерий
Подробности 11638

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, “И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное.”         В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм)  Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты.

Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или  липотейхоевые кислоты (от греч.

teichos – стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола  и рибитола, соединенных фосфатными мостиками.  Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий.  С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.

), которые располагаются снаружи также кластерами.  Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок.

Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран.

  Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра,  и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями. 

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные. 

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя. 

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.

  1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
  3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
  4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
  6. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек) 
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить 
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат
  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин) 
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
  8. Промыть и подсушить препарат
  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)  
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
  8. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
  2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)  
  3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
  4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
  5. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
  7. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)  
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

ПричинаРешение
Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)
  1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
  2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
  3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культураОкраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий – через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условияхПри выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)нет

Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ПричинаРешение
Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении
  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной \”густотой\” мазка
  2. Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
  3. При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
Мазок плохо обесцвечен
  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
  2. Повторить приготовление препарата и его окраску
  3. Дообесцветить имеющийся мазок
  4. Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки – заменить раствор.
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)нет

Источник: http://andromed.spb.ru/index.php/laboratornyj-praktikum/83-okraska-po-gramu

Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Окраска грамположительных бактерий

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки.

По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)).

Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) – сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных – от 2 до 8 нм.

В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий – периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами – β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой.

Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом – антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура – внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов.

Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют – предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки.

Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий – с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

  1. На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель – генцианвиолет или метиленовый синий.
  2. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
  3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
  4. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
  5. Производят дополнительное окрашивание – докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
  6. После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные – розовый или красный.

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный или розовый.

Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму.

Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя.

Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными – окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Источник: https://FB.ru/article/395322/okrashivanie-po-gramu-metodika-i-teoreticheskoe-obyyasnenie

О вашем здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: