Окраска мазков метиленовым синим

Содержание
  1. Основные методы окраски препаратов
  2. Окраска основным фуксином по Пфейферу
  3. Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
  4. Окраска карболовым тионином Николя
  5. Красящие растворы.
  6. Красящие смеси для грамположительных бактерий:
  7. Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:
  8. Приготовление красителя
  9. Методика окраски
  10. Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)
  11. Метиленовый синий и другие красители в микроскопии
  12. Как приготовить раствор метиленового синего
  13. Где взять метиленовый синий?
  14. Исследование микроорганизмов в живом виде
  15. Окраска дрожжей метиленовым синим
  16. Окраска клеток метиленовым синим и сафранином
  17. Препарат живых бактерий
  18. При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить :
  19. Простая окраска препаратов
  20. Виды красителей для приготовления образцов для микроскопа
  21. N + 1: Синька лечит. Зачем врачам понадобился краситель «метиленовый синий»
  22. От хинина до анилина
  23. Три кольца
  24. Жонглируя электронами
  25. Подсчет ретикулоцитов в мазке. Как считать ретикулоциты Окраска ретикулоцитов метиленовым синим – О сендромах
  26. Принцип метода
  27. Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим
  28. Метод 2 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II
  29. Метод 3 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I
  30. Фотографии ретикулоцитов:
  31. Подсчет ретикулоцитов в крови
  32. Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов
  33. Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов
  34. Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву
  35. Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов
  36. Окрашивание начального кариеса метиленовым синим
  37. Рентгенография
  38. Витальное окрашивание
  39. Высушивание эмали
  40. Методы диагностики начального кариеса

Основные методы окраски препаратов

Окраска мазков метиленовым синим

Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия.

Мазки окрашивают в течение 3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Окраска основным фуксином по Пфейферу

Вместо метиленового синего можно воспользоваться карбол-фуксином либо как таковым, либо в разведенном виде (1:10). Окрашивание длится от 15—30 секунд до 2—3 минут, в зависимости от степени разведения перекрашивания допускают дифференцировку 70° спиртом (10—20—30 секунд).

Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10—15 мл этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола.

Затем 3 капли полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью окрашивают мазки в течение 30 — 40 мин.

После этого ополаскивают водой, дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.

Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.

Окраска генциановым или метиловым фиолетовым

Для ориентировочной окраски бактерий можно воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 700 спиртом легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому, пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать. 

Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 — 5 мин через фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.

Окраска карболовым тионином Николя

Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 – 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.

Красящие растворы.

Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.

Красящие смеси для грамположительных бактерий:

1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;

2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;

3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;

4) 1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;

5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;

6) 8 – 9 г метиленового синего +100 мл спирта;

7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.

Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:

1) 8 — 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;

2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистиллированной воды;

3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;

4) 0,2 — 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.

Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 – 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя).

Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней.

Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Методика окраски

1.

Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.

Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)

Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.

Метиленовый синий и другие красители в микроскопии

Окраска мазков метиленовым синим

Для изучения микроорганизмов производят микроскопирование как живых, так и убитых микробов в неокрашенном и окрашенном виде.

Микроскопический препарат готовят на предметном стекле. Предметные стекла должны быть кристально чисты и абсолютно обезжирены. На поверхности обезжиренного стекла вода легко расплывается и не образует капель шаровидной формы.

Дочерние и родовые шрамы на поверхности дрожжевых клеток.

Новые стекла перед употреблением кипятят в 1%-ном растворе соды 10 минут, промывают водой, слабой соляной кислотой и хорошо прополаскивают в дистиллированной воде.

Стекла после исследования надо обработать раствором серной кислоты в течение 2 часов, хорошо промыть в воде и прокипятить 10 минут в 4%-ном растворе соды. Ополоснутые затем дистиллированной водой стекла протирают чистой полотняной тканью.

Хранить предметные стекла лучше всего в банке с притертой пробкой, погруженными в смесь спирта с эфиром, взятых в равных объемах. Из банки предметные стекла достают пинцетом.

Покровные стекла – тонкие стеклышки (толщиной 0,15-0,17 мм) размерами обычно 18х18 мм, 20х20 мм, 18х24 мм. Ими накрывают препарат на предметном стекле для изучения.

Как приготовить раствор метиленового синего

Физиологический раствор натрия хлорида с метиленовым синим: метиленовый синий 0,1 г; физиологический раствор натрия хлорида -100,0 мл.

Отвешивают указанное выше количество метиленового синего и помещают его в чистую бутылку. Прибавляют физиологический раствор натрия хлорида и тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов краски.

Для работы фильтруют небольшое количество раствора краски в капельницу.

Техника приготовления краски из сухого порошка. Некоторое количество порошка малахитового зеленого или метиленового синего растирают пестиком в чистой сухой ступке.

Отвешивают 3 г порошка краски, насыпают его в бутылку и прибавляют дистиллированную воду, чтобы получилось 100 мл раствора. Для приготовления рабочего раствора наливают 1 мл одного из полученных выше 3%-х водных растворов краски в бутылочку емкостью 250 мл.

Прибавляют 100 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды; перед использованием раствор тщательно перемешивают.

Где взять метиленовый синий?

Коврик, скальпель, метиленовый синий.

Если у вас домашний микроскоп, возникает вопрос, где брать препараты?

Всё очень просто: этот препарат продаётся в магазинах, он используется в аквариумистике. Смотрите на фото. Также для приготовления препаратов для микроскопа пригодится скальпель и коврик для резки (безопасный, вы не будете царапать под ним стол, он самовосстанавливающийся).

На фото – коврик для резки, скальпель и бутылочка метиленового синего. Всё приобретено в самом обычном (не специализированном) интернет-магазине.

Исследование микроорганизмов в живом виде

Плесневые грибы и дрожжи лучше рассматривать в живом виде в препарате «раздавленная капля». Клетки этих микроорганизмов относительно крупные, обычно при микроскопировании в живом виде хорошо выявляются их форма, размеры, детали внутреннего строения, характер размножения (почкование, деление, спорообразование и т.д.).

Бактерии чаще рассматривают в мертвом виде на фиксированных окрашенных препаратах (из-за их малого размера). При этом мы получаем более ясное представление о форме и размерах клеток, о способности их к спорообразованию.

В живом виде в «раздавленной капле» бактерии рассматривают в том случае, когда выясняют их способность к движению.

При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и эту смесь тщательно размешивают. Окраска живых дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку.

Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми и окрашены в синий цвет.

Окраска дрожжей метиленовым синим

Наибольшее распространение получил метод выявления мертвых клеток с помощью метиленового синего.

После попадания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Мертвые клетки окрашиваются в синий цвет.

Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности оксидоредуктаз в клетке.

Окраска клеток метиленовым синим и сафранином

Более полную информацию о физиологическом состоянии дрожжей дает окрашивание фиксированных препаратов метиленовым синим, танином и сафранином. Сафранин применяется для выявления клеточных ядер, которые окрашиваются в красный цвет. Если клетки живые и содержат оксидоредуктазы, расщепляющие метиленовый синий, то окрашенный препарат приобретает красноватый, а не фиолетовой оттенок.

Реактивы: краситель метиленовый синий; краситель сафранин; 5 %-й раствор танина в воде; физиологический раствор (0,9 %-й раствор NaCl).

Нанести каплю суспензии дрожжей на обезжиренное мылом предметное стекло. Оставить высыхать на воздухе при комнатной температуре. После высыхания капли зафиксировать препарат (10 раз провести стеклом в пламени спиртовки). Нагревать несильно, не пережигать.

Залить стекло раствором метиленового синего и выдержать в течение 4 минут при комнатной температуре. Смыть краситель теплой водой. Залить стекло свежеприготовленным раствором танина на 2 минуты. Смыть краситель под струей воды. Залить на 16 минут стекло раствором сафронина. Смыть краситель.

Микроскопирование следует проводить нефлюоресцирующим маслом при увеличении 400х.

Препарат живых бактерий

Морфология голодных и старых клеток (фотоувеличение 400х).

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии можно рассматривать и без добавления краски. Препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90 X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.

Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) специальной иглой (можно препаровальной) или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло.

Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с объективом 8Х. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.

) препарат рассматривают с объективом 40X.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить :

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимите фильтровальной бумагой.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если их много, препарат лучше приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают тут же после приготовления (особенно живых бактерий), так как в иначе вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки. После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 секунды, ни к чему не прикасаясь) и приступают к выполнению очередного этапа работы.

Морфологическая модель клетки.

Простая окраска препаратов

При простой окраске препаратов на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо красящего раствора (метиленового синего, разведенного фуксина и прочее). Для получения более чистых препаратов рекомендуется красящий раствор наливать на отрезок фильтровальной бумаги, которой покрывают мазок.

Раствор краски в среднем выдерживают на мазке 2-3 минуты (в зависимости от вида краски):

  • Фуксин красит интенсивно, причем окрашиваются одинаково хорошо все виды бактерий. Продолжительность окрашивания раствором фуксина вполне достаточна на протяжении 1-2 минут.
  • Щелочную метиленовую синь оставляют для окрашивания мазка на 2-3 минуты. Она красит менее сильно, но препарат получается более изящный, к тому же различные бактерии приобретают окраску различной интенсивности. При окраске метиленовой синью у крупных клеток (например, дрожжевых) дифференцируется ядро и цитоплазма.
  • Раствор генцианвиолета держат для окраски 3-5 минуты.

Виды красителей для приготовления образцов для микроскопа

Окраска клеток дрожжей иодонитротетразолиум хлоридом.

Красители в микробиологии являются солями двух типов: 1) кислые красители – у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (пример – эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (пример – метиленовый синий).

Кислые красители являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl).

Обычно кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Методы окрашивания основаны либо на микроскопировании в видимом (обычном) свете, либо на флуоресцентной микроскопии. Красителями для светового микроскопа являются метиленовый синий, раствор Люголяи др. Из флуоресцентных красителей применяют магниевую соль 1-анилино-8-нафтален сульфоновой кислоты (Mg-ANS), а также дигидрородамин.

Окраска клеток дигидрородамином в зеленом и красном спектре.

Источник: https://www.berl.ru/article/micro/Methylene-blue-and-other-dyes-in-microscopy

N + 1: Синька лечит. Зачем врачам понадобился краситель «метиленовый синий»

Окраска мазков метиленовым синим

Зачем врачам понадобился краситель «метиленовый синий»

Патологоанатомам случается видеть странные вещи. Среди них — человеческий мозг нежного фисташкового оттенка. Это не признак отравления, а отголосок интенсивного лечения метиленовым синим.

Однако точный диагноз «на глаз» не поставить: это вещество применяют при самых разных заболеваниях, среди которых малярия, приапизм, болезнь Альцгеймера и даже COVID-19.

Давайте разберемся в том, как биологическая краска стала таким многозадачным лекарством и есть ли от нее толк.

мозги фисташкового цвета (на манер «король «Оранжевое лето» гр. Браво)…
такой цвет мозговая ткань приобретает при длительном лечении метиленовым синим pic..com/geXUr1XDwA

— лиса с пинцетом Шора (@sitovskaya) August 26, 2020

От хинина до анилина

Лечить малярию корой хинного дерева врачи додумались еще в XVII веке, если не раньше. Но означенное дерево росло только в Южной Америке, причем исключительно на склонах Анд, и к XIX веку стало окончательно ясно, что на весь мир запасов коры не хватит.

Предприимчивые европейцы решили вывезти семена хинного дерева в Индию и Австралию, а правительство Перу, защищая свою монополию, шпионило за ними, устраивало на контрабандистов засады и бросало в тюрьмы.

И пока перуанские правоохранители бегали за одними европейцами по предгорьям Анд, другие пытались получить хинин искусственным путем, чтобы не утруждать себя отношениями с южноамериканскими стражами порядка.

Один из них, Уильям Перкин, немного промахнулся с реакцией синтеза и получил на выходе фиолетовый раствор. Так появился первый синтетический анилиновый краситель — мовеин. Целебными свойствами хинина он не обладал, но стойко красил ткань в замечательный яркий цвет, и поэтому заставил других исследователей ринуться на поиск других синтетических красок.

Окрашенный мовеином шелковый лоскут Перкин отправил вместе с письмом сыну (на фото)
Henry Rzepa / wikimedia commons / CC BY-SA 2.0

Через 20 лет, в 1876 году, немец Генрих Каро получил метиленовый синий. В отличие от анилиновых красителей, он не прижился в текстильной промышленности, зато быстро нашел свое место в лаборатории патологоанатома Карла Вайгерта, который приспособил его для окрашивания гистологических срезов — а оттуда уже попал к кузену Вайгерта, начинающему иммунологу Паулю Эрлиху.

Именно метиленовый синий приблизил ученого к Нобелевской премии: освоив новый краситель, Эрлих научился различать в мазке крови отдельные типы клеток. От препаратов он быстро перешел к экспериментам с животными и обнаружил, что метиленовый синий особенно хорошо оседает в нервных волокнах и головном мозге.

Исходя из этого, Эрлих предположил, что краситель может работать анальгетиком и блокировать передачу болевых сигналов — что вскоре подтвердил на практике.

Вместе с коллегой-психиатром Артуром Эппманном Эрлих задумывался и о том, что метиленовый синий можно было бы использовать и при психических расстройствах — но они так и не решились сделать следующий шаг и проверить эту идею на людях.

Мозг пациентки, которую не спасло лечение метиленовым синим
Seth Lummus et al. / Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 2013

Тем временем, оказалось, что синий краситель годится не только для животных тканей, но и для паразитов — в том числе, для того самого малярийного плазмодия, который оставался непобежденным.

Тогда Эрлих высказал новую идею: если краска накапливается внутри паразита в таких количествах, что выделяет его на фоне других клеток, то она может оказаться для него губительной — подобно тому, как, связываясь с болевым волокном, она тормозит передачу импульса.

И действительно, вскоре, в 1891 году, Эрлиху вылечил с помощью метиленового синего двух больных малярией. Так метиленовый синий стал первым лекарством, синтезированным искусственно.

Синяя краска была не самым надежным средством от малярии.

Но, за неимением лучшего, продержалась на позиции спасительного средства еще сорок лет, пока усилиям химиков-органиков не поддался наконец настоящий хинин и его производные (самый известный из которых — хлорохин).

Метиленовым синим лечили, например, солдат во времена мировых войн, а те были жутко недовольны, поскольку, кроме малярийного плазмодия, лекарство окрашивало в характерный цвет белки глаз, кожу и мочу.

Впрочем нелюбимый солдатами побочный эффект был скорее на пользу — позволял проследить, действительно ли пациент принял лекарство.

Поэтому метиленовый синий использовали для контроля за приемом таблеток в психиатрических клиниках, где пациенты особенно ненадежны. И до сих пор продолжают применять в странах Африки.

Особенно удобно назначать краситель детям: по синим каплям на одежде или подгузнике всегда видно, чьи родители честно выполняют назначения врача.

Три кольца

Эрлих и Эппманн не рискнули проверить действие метиленового синего на людях с психиатрическими диагнозами. Их итальянский коллега, Пьетро Бодони, оказался смелее: в 1899 году он накормил красителем 14 пациентов с психозом и отчитался — все они быстро успокоились.

Впрочем, опыты Бодони не вызвали большого ажиотажа, и возможно, метиленовый синий так и не привлек бы внимания психиатров, если бы не его родственники.

В попытках получить другие противомалярийные препараты химики произвели на свет целую линейку веществ того же семейства — фенотиазинов. Все они от плазмодия спасали с трудом, зато неплохо помогали успокоить пациентов перед операцией.

Самый, пожалуй, известный из них — хлорпромазин — до сих пор используют как транквилизатор в психиатрических клиниках.

Сверху: серотонин и хлорпромазин, снизу анилин и метиленовый синий
CC0

В основе всех фенотиазинов (и метиленового синего в том числе) лежат три кольца: два чисто углеродных, ароматических, и еще одно с вкраплениями азота и серы.

Такая структура, с одной стороны, делает эти вещества гидрофобными и помогает им проходить через мембрану клеток, а значит, преодолевать барьер между кровью и нервной тканью мозга. С другой стороны, своими кольцами они похожи на моноаминовые нейромедиаторы, например, дофамин и серотонин.

Поэтому фенотиазины способны связываться с разными рецепторами для нейромедиаторов и с веществами, которые участвуют в их обмене (например, моноаминоксидазой) — а значит, могут влиять на передачу сигналов в мозге и его работу.

Среди своих психоактивных родичей метиленовый синий лучше всех изучен и проверен временем. Поэтому, как только стало ясно, на что способны фенотиазины, синий краситель бросились проверять на другие неожиданные неврологические качества.

Метиленовый синий пытались применять при разных видах психоза, обнаружили у него (как и у других блокаторов моноаминоксидазы) свойства антидепрессанта и даже замахнулись было на шизофрению.

Правда, до сих пор не появилось никаких убедительных данных о том, что краситель как-то от нее помогает.

Позже метиленовый синий, конечно, проверили и против болезни Альцгеймера. Выяснилось, что он мешает молекулам белка тау собираться в токсичные агрегаты внутри нейронов — и это дало основу для клинических испытаний терапии, которые идут сейчас.

Кроме того, оказалось, что метиленовый синий повышает результаты тестов на когнитивные функции не только у тех, кто лечится от деменции, но и у здоровых людей — по крайней мере, в том, что касается концентрации внимания и рабочей памяти.

Так метиленовый синий стал еще и кандидатом в ноотропы и объектом внимания биохакеров.

Впрочем, даже они не забывают напоминать, что технология еще не отработана, а при передозировке возможны побочные эффекты — например, серотониновый синдром, который в редких случаях смертелен.

Жонглируя электронами

Когда Эрлих заметил, что его новая краска скапливается в нервных тканях, он еще не знал о существовании моноаминоксидазы и нейромедиаторов. У него на этот счет была своя теория.

Он довольно быстро выяснил, что метиленовый синий может работать как окислитель и восстановитель: он может отдать электрон, теряя при этом цвет, а потом становится синим снова, если отберет электрон у кислорода.

Именно поэтому, думал Эрлих, краситель тяготеет к нервной ткани — она потребляет много кислорода, а значит, там есть запас электронов.

Кое в чем Эрлих снова оказался прав. Метиленовый синий действительно вступает в окислительно-восстановительные реакции (поэтому, например, окрашенные им ткани синеют на воздухе, а потом постепенно блекнут).

Именно это свойство — в нужный момент поделиться своими электронами и вызвать в клетке окислительный стресс — позволило ему победить малярийного плазмодия, а затем и других паразитов.

Поэтому сегодня, например, врачи прописывают метиленовый синий для лечения бактериальных урологических инфекций.

Это же свойство — отдавать электроны — оказалось полезно и в другом контексте, при метгемоглобинемии. Метгемоглобин — это форма гемоглобина, в которой он не может связывать кислород, поскольку железо в его составе находится в неправильной степени окисления (не +2, как обычно, а +3).

Такая форма может возникать и в норме, но обычно составляет несущественный процент от всего гемоглобина в эритроцитах. А вот при отравлении некоторыми веществами такого гемоглобина становится много, и насыщение крови кислородом резко падает.

От этого как раз и спасает метиленовый синий, отдавая атому железа свой электрон.

В редких случаях метгемоглобинемия бывает наследственной — тогда дефицит кислорода становится постоянным, а кожа человека приобретает синеватый оттенок. Такие формы тоже лечат с помощью метиленового синего: именно он, как это ни парадоксально, помог порозоветь семейству синих людей из Кентукки, которые передавали метгемоглобинемию из поколения в поколение.

На этом достижения метиленового синего не заканчиваются. Благодаря своим электронам — то лишним, то недостающим — он блокирует производство двух важных провоспалительных веществ: оксида азота и арахидоновой кислоты.

Поэтому его можно применять в самых разных случаях, когда речь идет об избыточном воспалении: при анафилактическом и септическом шоке, при пониженном давлении и ишемии, его пробовали использовать даже при приапизме и анальном зуде.

Неудивительно, что о нем снова вспомнили и в начале коронавирусной пандемии: первая фаза клинических испытаний метиленового синего против COVID-19 должны завершиться в сентябре.

Таким образом, обладатель фисташкового мозга, прославившийся недавно в твиттере, при жизни мог быть кем угодно: больным малярией жителем Африки, участником очередных клинических испытаний, бесстрашным биохакером или просто онкобольным, которому метиленовый синий вводили как краситель (да-да, иногда его еще используют по прямому назначению), чтобы определить границу здоровой ткани. Однако, кем бы он ни был, инъекция синей краски ему не помогла остаться в живых — и это напоминает о том, что, даже если метиленовый синий и окажется панацеей, то мы пока не умеем ею пользоваться.

Полина Лосева

Оригинал

Источник: https://echo.msk.ru/blog/nplus1/2703753-echo/

Подсчет ретикулоцитов в мазке. Как считать ретикулоциты Окраска ретикулоцитов метиленовым синим – О сендромах

Окраска мазков метиленовым синим

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

см. также статьи Ретикулоциты и Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Можно использовать один из следующих красителей:

  1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
  2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% – 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
  3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Микроскоп.

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски.

В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин.

Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Окраска ретикулоцитов Ретикулоциты Ретикулоциты Ретикулоциты

Reticulocytes

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения.

Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Клиническое значение определения количества ретикулоцитов.

  • Справочник “Лабораторные методы исследования в клинике” под редакцией Меньшикова В. В. – Москва, “Медицина”, 1987 г
  • Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы – “Клинические лабораторные исследования” – Москва, “Медицина”, 1984 г.

Метод подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Тельца Жолли (тельца Хауэлла-Жолли) – мелкие круглые фиолетово-красные включения размером 1 – 2 мкм, встречаются по 1 (реже по 2 – 3) в одном эритроците. Предсталяют собой остаток ядра после удаления его РЭС. Выявляются при интенсивном гемолизе и “прегрузке” РЭС, после спленэктомии, при мегалобластной анемии..

Раздел: Гемоцитология

Читать

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Читать

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче.

Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи.

По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

Раздел: Анализ мочи

Читать

Источник: http://www.clinlab.info/Hemocytology/Reticulocytes-counting-49

Подсчет ретикулоцитов в крови

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные стекла.
  2. Шлифованные предметные стекла.
  3. Влажная камера.
  4. Смесители для белых и красных кровяных телец.
  5. Стекла с луночкой.
  6. Микроскоп.
  7. Бриллианткрезиловая синька.
  8. Абсолютный этиловый спирт.
  9. Метиловый спирт или смесь Никифорова (равные части этилового 96° спирта и эфира).
  10. Реактив Гайема или 3% раствор поваренной соли.
  11. Иммерсионное масло.
  12. Набор инструментов для укола в палец.

В зависимости от строения зернисто-сетчатой субстанции различают пять видов ретикулоцитов: пылевидный, венчикообразный, неполносетчатый, полносетчатый и клубкообразный (см. рис).

Различные группы ретикулоцитов по степени зрелости

Взятие крови с целью подсчета в ней ретикулоцитов производят по указанию врача. Чтобы подсчитать количество ретикулоцитов, их окрашивают. С этой целью используют:

  1. Способ прижизненной (суправитальной) окраски ретикулоцитов.
  2. Способ одновременной суправитальной окраски тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву.

Рассмотрим данные способы более подробно.

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

  1. Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
  2. Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
  3. Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови.

Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как тромбоциты, с ограничителем поля зрения.

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева.

В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды.

Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха.

Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом.

Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки.

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Ретикулоциты, окрашенные по Алексееву

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/blood/podschet_retikulocitov_v_krovi/39-1-0-760

Источник: https://osendro.ru/podschet-retikulocitov-v-mazke-kak-schitat-retikulocity-okraska-retikulocitov-metilenovym-sinim.html

Окрашивание начального кариеса метиленовым синим

Окраска мазков метиленовым синим

Электроодонтометрия — определение порога чувствительности пульпы к электрическому току. Она основана на раздражении пульпы зуба электрическим током и улавливании минимальной силы тока, которая вызывает первое (слабое) болевое ощущение.

Здоровая пульпа зуба реагирует на ток силой 2—6 мкА. Снижение возбудимости до 20—40 мкА свидетельствует о воспалении коронковой пульпы, реакция зуба на ток силой 60 мкА — о вовлечении в патологический процесс и корневой пульпы.

Реакция на ток силой 100 мкА и выше подтверждает наличие некроза пульпы.

Рентгенография

Рентгенологическое исследование зубов и челюстей имеет важное диагностическое значение. При диагностике кариеса к рентгенографии прибегают в случае подозрения на образование кариозной полости на контактной поверхности зубов при их тесном расположении, когда дефект твердых тканей недоступен осмотру и зондированию.

Рентгенография — эффективный метод исследования при диагностике хронических апикальных периодонтитов.

Это исследование позволяет выявить анатомическое строение корней зубов и каналов, их число, форму и полозкение в челюсти, наличие облитерации полости зуба, состояние периодонта и костной ткани; четко определить переломы корней зубов и самой челюсти, степень заполнения корневых каналов пломбировочным материалом, наличие инородных тел в канале корня, степень резорбции альвеолярного отростка. Панорамная рентгенография дает возможность получить изображение всего зубного ряда.

Витальное окрашивание

Витальное окрашивание основано на повышении проницаемости пораэкенных кариесом твердых тканей зубов для водных растворов красителей (метиленовый синий или красный). При контакте с растворами красящих веществ в участках деминерализации твердых тканей краситель сорбируется, тогда как неизмененные ткани не окрашиваются.

С помощью этого метода удается не только выявить очаговую деминерализацию эмали, но и судить об активности патологического процесса. Наибольшее распространение получило окрашивание эмали и дентина 2 % водным раствором метиленового синего.

При этом на поверхность зубов, предварительно очищенную, высушенную и изолированную ватными валиками, наносят на 3 мин краситель, после чего тампоны удаляют и смывают с зуба остатки красителя.

Оценку окрашивания эмали проводят либо с помощью специальной шкалы, имеющей различные оттенки синего цвета, либо визуально, подразделяя интенсивность на легкую, среднюю и высокую, что соответствует степени деминерализации эмали.

Витальное окрашивание применяют и для индикации пораженного дентина на дне кариозной полости (краситель вносят на 1 мин), а также для контроля за эффективностью реминерализирующей терапии, дифференциации начального кариеса (стадия пятна) от флюороза и гипоплазии. При последних, как и при интактной эмали, прокрашивания тканей зуба не происходит. После проведения данного теста цвет эмали восстанавливается до нормального в течение получаса.

Высушивание эмали

Высушивание эмали — наиболее простой и довольно эффективный метод, позволяющий выявлять даже очаги подповерхностной деминерализации, обнаружение которых под слоем слюны практически невозможно. Исследуемый зуб тщательно очищают от налета и после высушивания определяют границы и размеры очага деминерализации. Этот метод применяется и при диагностике кариеса аппроксимальных поверхностей.

источник

Методы диагностики начального кариеса

Методы диагностики начального кариеса

Высушивание.Этот метод выявления очагов деминерализации эмали в виде белого пятна наиболее прост и эффективен в условиях стоматологического кабинета.

При высушивании вода испаряется из микропространств эмали и пятно становится матовым и видимым. Обследуемый зуб очищают от налета, изолируют от слюны и поверхность высушивают воздухом. Визуально определяют размеры очагов деминерализации.

При осторожном зондировании поверхность эмали в области белого пятна шероховатая, но плотная.

Витальное окрашиваниеосновано на повышении проницаемостипораженных кариесом твердых тканей зуба. В деминерализованные твердые ткани краситель проникает и окрашивает их, здоровые ткани в цвете не изменяются.

Для дифференциальной диагностики начального кариеса на очищенную от мягкого зубного налета поверхность зуба помещают на 2-3 минуты ватный шарик, смоченный 2 % раствором метиленового синего. Затем излишки красителя смывают водой.

Для объективной оценки интенсивности окраски используют стандартную цветовую шкалу, предусматривающую различные оттенки синего цвета – от слегка голубоватого до интенсивно-синего.

Колориметрический тест.Методика заключается в последовательном полоскании полости рта 0,1% раствором глюкозы и 0,15 % раствором метиленового красного. На участках эмали, где происходит изменение рН в кислую сторону, при показателях 4,4-6,0 и ниже меняется окраска от красного до желтого цвета. Уровень выявления кариеса составляет 74,8 % (Hardwick).

Люминисцентное исследование.Метод люминисцентной диагностики осно­ван на способности тканей под воздействием ультрафиолетовых лучей изменять свой естественный цвет. Исследование проводят в затемненной комнате. На высушенную поверх­ность зубов направляют пучок ультрафиолетовых лучей из люминисцентного осветителя (ОЛД — 41, Pluraflex) с расстояния 20-30 см.

Здоровые твердые ткани зубов в ультрафиолетовых лучах флюоресцируют снежно-белым, голубоватым свечением. При наличии кариозного пятна отмечается гашение люминисценции на фоне нормального свечения окружающей здоровой эмали.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения:Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 10255 — | 7942 — или читать все.

Источник: https://tepcontrol.ru/okrashivanie-nachalnogo-kariesa-metilenovym-sinim/

О вашем здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: