Определение токсигенности дифтерийной палочки

Все о диагностике дифтерии

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.

  • Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
  • Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
  • Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
  • Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
  • При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
  • Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
  • Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.

Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.

Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.

В каких случаях проводится бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:

  • с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
  • с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
  • с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.

Материал для исследования

Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.

Методика забора материала

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.

В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.

При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).

Культивирование бактерий дифтерии

Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.

При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.

При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.

Идентификация биотипа (разновидности штамма) дифтерии

Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.

Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.

Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.

Определение токсикогенности дифтерийных палочек

Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).

Методика бактериоскопии

Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.

При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.

В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.

Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.

Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.

Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.

Серологическая диагностика дифтерии

Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).

Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.

Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.

Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.

При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.

Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.

Диагностика дифтерии с помощью иммунофлуоресцентного анализа

Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.

Диагностика дифтерии с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Диагностика осложнений при дифтерии

  • При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
  • Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
  • Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
  • Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.

Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.

В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.

 

ССЫЛКИ ПО ТЕМЕ

Статьи раздела “Дифтерия”Самое популярное  

Источник: https://microbak.ru/infekcionnye-zabolevaniya/difteriya/diagnostika-difterii.html

Патогенетическая микробиология (часть 2) | Издательство ПИМУ – Part 3

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Подобно всем бактериальным токсинам, действующим внутриклеточно, дифтерийный токсин является бинарной молекулой, т.е. состоит из двух фрагментов — А и В, выполняющих соответственно ферментативную (расщепление НАД, АДФ-рибозилирование) и рецепторную функции.

Фрагмент В связывается с рецепторами клеток (гепаринсвязывающим эпидермальным фактором роста), способствуя внутриклеточному транспорту А-компонента. Этому сопутствует расщепление молекулы токсина мембранными протеазами и высвобождение активированного А-фрагмента.

Полагают, что высокая чувствительность к дифтерийному токсину миоцитов сердца и нервных клеток объясняется повышенным содержанием в них гепаринсвязывающего эпидермального ростового фактора.

Определение токсигенности изолированной культуры венчает микробиологический анализ при подозрении на дифтерию: лишь выделение токсигенных культур имеет диагностическое значение.

Дифтерийная палочка активно продуцирует токсин, поэтому для его обнаружения вполне достаточно не очень чувствительного, но весьма демонстративного метода двойной (встречной) иммунодиффузии в геле, который по автору называется реакцией Оухтерлони (рис. 4).

Рис. 4. Определение токсигенности C. diphtheriae (реакция гелевой иммунодиффузии по Оухтерлони). Горизонтально расположена полоска бумаги, пропитанная антитоксической сывороткой. Три культуры дифтерийной палочки посеяны перпендикулярно полоске с антитоксином. Токсигенные штаммы дают V-образную линию преципитации, которая формируется в зоне оптимального соотношения антиген—антитело.

Штаммы в центре и слева продуцируют токсин (линии преципитации сливаются). Штамм, посеянный справа, лишен токсигенности. Культивирование на элективной среде в течение 48 ч при 37,5оС с последующей экспозицией 48 ч при 4оС

Представления о дифтерии как о специфической интоксикации сыграли решающую роль в борьбе с этой инфекцией.

Выздоровление связано с образованием антител, нейтрализующих токсин. Этому можно содействовать, вводя больному готовые антитела в виде антитоксической сыворотки или ее иммуноглобулиновой фракции. Антитоксическую сыворотку получают от гипериммунизированных лошадей, так что следует считаться с возможностью аллергических осложнений на введение чужеродного (гетерологичного) белка.

Они бывают разной тяжести и наблюдаются примерно в 10% случаев. Но это терапия выбора и начинать ее следует как можно раньше, так как, нейтрализуя свободный токсин, антитела бессильны против токсина, связавшегося с клетками, а тем более уже проникшего в них. Это означает, что сигналом к иммунотерапии должен быть клинический диагноз дифтерии.

Выделение токсигенной культуры служит хоть и важным, но все-таки запоздалым подтверждением. Антибиотики приносят пользу, но не заменяют антитоксина.

Блестящим развитием идеи о дифтерийной интоксикации явилась разработка подходов к искусственному созданию активного иммунитета против дифтерии. В 1920-х гг. французским ученым Г. Рамоном разработан способ обезвреживания (детоксикации) дифтерийного токсина с сохранением его иммуногенных свойств.

Такой препарат (он называется анатоксином) получают путем обработки токсина 0,3% раствором формальдегида, который сшивает остатки лизина и тирозина, образуя метиленовые мостики. Анатоксин не связывается с клеточными рецепторами, не обладает АДФ-рибозил-трансферазной активностью и не расщепляется на А—В-фрагменты.

Этим объясняется его полная безвредность. Глобальное применение анатоксина для вакцинации детей (его обычно применяют в виде преципитата на гидроокиси алюминия — адсорбированный анатоксин) привело к резкому сокращению дифтерии.

Многочисленными исследованиями доказано, что восприимчивость к дифтерии зависит от уровня антитоксического иммунитета, и лишь нарушения в вакцинной практике срывают программу ликвидации этой инфекции. Это, в частности, привело к недавнему росту заболеваемости дифтерией на территории бывшего Советского Союза. Так, в 1994 г.

было зафиксировано почти 50 000 случаев дифтерии, из которых 1750 закончились смертельным исходом. Болели преимущественно взрослые и дети старшего возраста, утратившие иммунитет и не восполнившие его дефицит путем своевременной ревакцинации.

Антитоксические антитела с опережением нейтрализуют токсин, образующийся во входных воротах инфекции. Это исключает повреждение тканей, предупреждая образование фибринозных пленок, которые стабилизируют инфекцию, способствуя ее патогенетически значимой эволюции.

Без такой опоры дифтерийная палочка обычно надолго не задерживается на слизистых оболочках.

Впрочем, как уже говорилось, примеры бессимптомного носительства токсигенных штаммов дифтерийной палочки на фоне протективных титров антитоксических антител, а также присутствие в зеве ее нетоксигенных вариантов говорят о том, что токсин не является обязательным фактором колонизации.

Совершенно очевидно, что подобно другим коринебактериям дифтерийная палочка располагает поверхностными структурами, которые обеспечивают ее адгезию на эпителиоцитах. Их природа не известна, но это рождает естественное стремление расширить тактику превентивной борьбы против дифтерии.

Главные идеи связаны с предупреждением колонизации слизистых оболочек и эпидемиологически значимого носительства возбудителя. Надежды возлагаются на вакцинные препараты из компонентов самих бактерий, т.е. на создание антибактериального иммунитета, который смог бы усилить элиминирующие потенции антитоксических антител.

Хочется верить, что эта логика принесет плоды, но она должна базироваться на грамотных представлениях о факторах микробной колонизации и не повторять тщетных попыток прошлого. У человечества уже есть «синица в руках» — анатоксин, который отлично зарекомендовал себя в борьбе с дифтерией. Не исключено, что «журавль в небе» не понадобится, если организованно поддерживать классический опыт анатоксиновой иммунопрофилактики.

Микобактерии туберкулеза

По опустошительному своему действию туберкулез занимает первое место среди других болезней.
Энциклопедический словарь Брокгауза—Эфрона, 1902

  • Экологические разновидности микобактерий.
  • Клеточная стенка: микробиологическое и патогенетическое своеобразие туберкулезной палочки.
  • «Болезнь макрофагов».
  • Туберкулезная гранулема: эволюция неспецифических и специфических механизмов.
  • Аллергия и иммунитет.
  • Болезнетворность: прямые и опосредованные эффекты.
  • Персистенция, реактивация и патогенетические варианты туберкулеза.
  • Специфическая диагностика: возможности, ограничения, перспективы.
  • Вакцинопрофилактика: иллюзия безопасности.
  • Этиотропная терапия: классика и тревоги будущего.

Название болезни «туберкулез» происходит от характерного патоморфологического признака — специфической гранулемы, или туберкула. Это очаг хронического, иммунологически зависимого воспаления, которое в типичном виде выглядит как небольшой бугорок (лат. tuberculum), внешне и гистологически отличающийся от гранулем иного происхождения.

Слово «туберкул» впервые употребил в XVI в. Ф.Сильвий при описании поражений легких у людей, умерших от чахотки (греч. phtisis — истощение; отсюда — фтизиатрия, фтизиатр). В качестве самостоятельного понятия «туберкулез» стали использовать в XIX в. после того, как Ж.Бейль и Р.

Лаэннек доказали, что образование туберкулов — непременный спутник болезни.

Туберкулез известен с глубокой древности и почти наверняка причинил человечеству больше страданий, чем любая другая инфекция. Несмотря на блестящие достижения этиотропной терапии, он и сегодня остается тревожной проблемой. Прогноз ВОЗ в 1960 г.

о том, что туберкулез в ближайшее время будет ликвидирован как широко распространенное заболевание, не состоялся, и уже в 1993 г. было заявлено, что туберкулезная инфекция выходит из-под контроля. В современных публикациях туберкулез часто упоминается среди так называемых возрождающихся и вновь возникающих (англ. emerging/reemerging) инфекций.

Ежегодно на Земном шаре от туберкулеза умирает более 3 млн. человек, и вряд ли следует ожидать быстрого улучшения ситуации.

Догадки о заразности туберкулеза восходят к далекому прошлому, но лишь в 1868 г. Ж. Вильмену удалось воспроизвести заболевание у животных при заражении мокротой от больных туберкулезом.

Удивительно, но эти исследования (как и более поздние работы Ю.Конгейма) не убедили современников.

Туберкулез продолжали связывать с самыми невероятными «капризами природы», и лишь работы Роберта Коха утвердили его инфекционное начало.

В марте 1882 г. на заседании Берлинского физиологического общества Кох сообщил о своих исследованиях по этиологии туберкулеза. В мокроте туберкулезных больных он обнаружил палочки, которые по тинкториальным свойствам и росту на питательных средах отличались от всех известных тогда бактерий.

Заражение чистыми культурами вызывало туберкулезный процесс у животных. В докладе было немало и других сведений о происхождении одной из самых страшных болезней человека. Нельзя не поражаться огромной творческой силе, которая потребовалась Коху, чтобы выполнить поставленные перед собой задачи.

Дело в том, что туберкулезная палочка не выявляется при обычной окраске, растет во много раз медленнее других бактерий, а ее выделение в чистой культуре представляет трудности даже для современных бактериологов. Исследования по туберкулезу явились главным основанием для присуждения Р.

Коху одной из первых Нобелевских премий по медицине.

Таксономия и разновидности

Туберкулез человека вызывают два вида микобактерий — Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis (микобактерии бычьего типа). Их нетрудно различить по ряду признаков, но этого часто не требуется, так как современный туберкулез обычно связан с М. tuberculosis.

Если быть точнее, следует говорить о так называемом туберкулезном комплексе, или группе М. tuberculosis. Кроме М. tuberculosis и М. bovis сюда входят еще два вида микобактерий — М. africanum и М.microti. Из них лишь М.

africanum изредка вызывает туберкулез у человека, причем не только среди жителей Африки (как следует из видового эпитета), но и в других регионах. Памятуя о микробиологической неоднозначности туберкулеза, мы тем не менее будем ориентироваться на главный вид, М.

tuberculosis, с которым связано более 90% случаев туберкулеза, регистрируемых на Земном шаре. Кроме того, М. tuberculosis и М. bovis так похожи, что некоторые специалисты до сих пор считают их вариантами одного вида.

Источник: https://medread.ru/patogeneticheskaya-mikrobiologiya-2/3/

О вашем здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: