Определение токсигенности

Определение токсигенности дифтерии

Определение токсигенности

С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.

Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.

Бактериоскопия дифтерийной палочки

Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование дифтерийной палочки

Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке).

Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).

Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой.

Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека.

На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином.

Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски.

Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.

Фаготипирование дифтерийной палочки

Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде.

В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или “усов”.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

https://www.youtube.com/watch?v=pz8FHReRu3g

Культуру засевают в виде “бляшек” диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 “бляшек”.

Из них 6 “бляшек” испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных “бляшек” и 4 — испытуемых.

Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки.

Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты).

Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты.

Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Источник: https://UziMaster.ru/opredelenie-toksigennosti-difterii/

Определение токсигенности микробов

Определение токсигенности

Впатологии человека большую роль играюттоксигенные микроорганизмы, к которымотносятся возбудители ботулизма,столбняка, газовой анаэробной инфекции,дифтерии, а так­же некоторые штаммыбактерий дизентерии Григорьев -Шига,стафилококка и стрептококка и некоторыедругие.

Экзотоксины,вырабатываемые различными представите­лямиэтой группы микробов, обладают резковыраженной токсичностью, высокойизбирательностью действия с пораже­ниемотдельных органов и тканей и способностьюпри парен­теральном введении в организмвызывать образование анти­тел—антитоксинов,способных нейтрализовать соответствую­щиеим экзотоксины.

Продуцируемыев процессе жизнедеятельности микробаэкзотоксины легко диффундируют изклетки в окружающую их питательнуюсреду. Бульонную культуру микробавыдер­живают в термостате в течение2—3 недель для накопления в ней токсина,затем фильтруют через бактериальныйфильтр. Получаемый при этом прозрачныйфильтрат содержит неразведенный токсин.

Токсигенностьмикробов определяют по тому же принципу,что и вирулентность. Единицами измерениятоксигенности, как и вирулентности,являются минимальная смертельная до­за(Dlm)и средняя смертельная доза (LD50).

Дляопределения Dlmи LD50фильтрат бульонной культуры разводятстерильным изотоническим растворомхлорида натрия в сотни, тысячи и миллионыраз.

Каж­дую дозу токсина испытываютодновременно на 6—10 жи­вотных. Дляпостановки проб подбирают животных,наибо­лее чувствительных к исследуемомутоксину.

Например, дифтерийный токсинтитруют на морских свинках, столбнячныйтоксин—на мышах.

Приучете полученных результатов в протоколеопыта от­мечают дозу введенноготоксина, способ его введения, массу телаживотного и время наступления его гибелипосле введе­ния токсина.

Литература

  1. Аристовский В.М. др. Учебник медицинской микробиологии. — М: Медгиз, 1949.

  2. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О, — М: «Медицина», 1982.

  3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. —М.: «Медицина», 1978.

  4. Методы общей бактериологии в 3-х т. — М:, «Мир», 1983.

  5. Розанов Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. — М:, ГИСХИ. 1952.

  6. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федоров В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. — М.: «Колос», 1995.

  7. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. — М.: Медгиз, 1958.

Оглавление

Введение 3

Бактериологическая лаборатория 3

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 4

Правила работы и поведения в лаборатории 7

Уборка лабораторного помещения 8

Мытье и обработка лабораторной посуды 9

Дезинфекция 13

Стерилизация 14

Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования 14

Виды стерилизации 16

Микроскопические методы исследования 21

Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов 21

Приготовление мазков 26

Окраска мазков 28

Простые методы окраски мазков 31

Окраска по Муромцеву 31

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков 32

Окраска по Граму 32

Видоизменения метода окраски по Граму 34

Окраска по Граму в модификации Хукера. 35

Окраска по Граму в модификации Берка. 36

Модификация по Синеву. 38

Модификация по Эткинсу. 39

Окраска кислотоустойчивых микробов 40

Окраска по методу Циль-Нильсена 40

Метод Труанта для окрашивания на кислотоустойчивость. 41

Метод Гонзеля 42

Метод Бунге и Траутенрота 43

Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость) 43

Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость) 43

Способ Нейссера 44

Метод Пью (окраска метахроматических зерен) 44

Окраска по Романовскому-Гимза 45

Окраска капсул 46

Метод окраски капсул по Дюгиду 46

Метод окраски капсул по Гиссу 46

Метод окраски капсул по Антони 47

Способ Михина 47

Способ Гисса 47

Способ Ольта 48

Способ Ребигера 48

Способ Гусельниковой 48

Способ Кауфмана 49

Способ Ионе 49

Окраска спор 49

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру 50

Метод окраски эндоспор по Шефферу–Фултону 51

Метод Виртца в модификации Саватеева 51

Способ Пешкова 52

Способ Мюллера 52

Способ Ауески 53

Способ Клейна 53

Окраска жгутиков 54

Метод окраски жгутиков по Грэю 55

Метод окраски жгутиков по Ляйфсону 56

Окраска жгутиков серебрением 57

Способ Уварова 59

Способ Леффлера 59

Способ Инуйе 60

Способ Бениньетти и Джино 60

Цитоплазматические включения 60

Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты 61

Окрашивание полифосфата 61

Окрашивание полисахаридов с использованием реак­тива Шиффа 61

Метод окраски полисахаридов альциановым синим 62

Питательные среды 63

Техника посева микроорганизмов 70

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды 72

Получение чистых культур 74

Посев штрихом 75

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) 76

Выделение чистой культуры по способу Дригальского 77

Анаэростат для культивирования анаэробов 77

Методы, позволяющие изучить культуральные свойства микроорганизмов 77

Рост микробов на плотной питательной среде 77

Особенности микробного роста на жидких питательных средах 80

Рост на полужидкой питательной среде 81

Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов 81

Сахаролитические свойства микроорганизмов 82

Протеолитические свойства микроорганизмов 83

Определение индола в культуре микроор­ганизмов 85

Определение сероводорода 85

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов 85

Определение редуцирующей способности 86

Определение фермента каталазы 86

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам 87

Лабораторные животные 89

Краткие сведения о содержании, разведении, кормлении и заболеваниях лабораторных животных 90

Правила пополнения вивария новыми животными 91

Правила содержания экспериментальных животных в ви­варии 93

Уборка и дезинфекция вивария 97

Личная гигиена работников питомника (вивария) 98

Правила кормления лабораторных животных 98

Заболевания лабораторных животных 100

Подготовка животных к заражению 102

Фиксация, методы заражения и взятия крови у лабораторных животных 106

Способы заражения 110

Наркоз лабораторных животных 110

Внутрикожный метод 111

Подкожный способ заражения 111

Внутримышечный способ заражения 112

Внутрибрюшинный способ заражения 112

Внутривенное заражение кроликов 112

Внутривенное заражение крыс и мышей 113

Заражение через пищеварительный тракт 113

Заражение через дыхательные пути (интраназальное зара­жение) 115

Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод) 115

Внутримозговой метод (интрацеребральный) 115

Внутриплевральный метод 116

животных под опытом 116

Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка 116

Умерщвление и вскрытие лабораторных животных 120

Вскрытие животных 121

Определение вирулентности микробов 124

Определение токсигенности микробов 125

Литература 126

ДмитрийАркадьевич Васильев Сергей НиколаевичЗолотухин

АнатолийАнисимович Щербаков

ЛидияВладимировна Карпунина

Источник: https://studfile.net/preview/1838837/page:53/

О вашем здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: